Xây dựng mô hình chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm dược liệu Cordyceps militaris G12
Nghiên cứu được thực hiện bởi tác giả Trần Văn Tuấn - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và tác giả Vũ Xuân Tạo - Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ, Bộ KH&CN.
Cordyceps militaris là một loài nấm dược liệu quý và đã được chứng minh là có chứa nhiều hoạt chất có lợi cho sức khỏe, như adenosine, cordycepin, pentostatin, polysaccharide, carotenoid. Do đó, loài nấm này gần đây được coi là mô hình triển vọng để nghiên cứu cơ chế phân tử của quá trình hình thành quả thể và sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học. Phát triển các hệ thống chuyển gen hiệu quả ở C. militaris sẽ góp phần quan trọng trong việc thực hiện các nghiên cứu cải biến di truyền loài nấm dược liệu này.
Gần đây, hai hợp chất có hoạt tính kháng ung thư là cordycepin và pentostatin do một nhóm các gen chuyên biệt chịu trách nhiệm sinh tổng hợp đã được phát hiện có mặt trong hệ gen của C. militaris. Tuy nhiên, năng lực sinh tổng hợp các chất có lợi của các chủng tự nhiên thường tương đối thấp. Việc can thiệp vào hệ gen nấm bằng kỹ thuật di truyền có thể giúp tăng hiệu suất sinh tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học mong muốn.
Trong nghiên cứu hiện tại, một chủng C. militaris thu thập tại Việt Nam được định danh chính xác về mặt phân loại dựa trên các đặc điểm hình thái và giải trình tự cùng ITS của rDNA. Chủng này được đặt tên là C. militaris G12 và được sử dụng để nghiên cứu chuyển gen. Chủng C. militaris G12 được đánh giá về mức độ mẫn cảm với ba loại kháng sinh phổ biến dùng trong chuyển gen là hygromycin, nourseothricin và phleomycin.
Vật liệu nghiên cứu: Mẫu quả thể nấm (ký hiệu G12) thu thập từ cơ sở nuôi trồng nấm C. militaris ở Hà Nội được dùng để phân lập chủng nấm thuần khiết dùng cho nghiên cứu.
Phân lập và quan sát hình thái: Tách 1 phần sợi quả thể nấm, làm sạch sơ bộ bằng nước cất và khử trùng bề mặt quả thể bằng cồn. Sau đó phần sợi quả thể được cắt bỏ ở hai đầu, phần giữa được cắt thành các lát nhỏ và đặt lên môi trường PDA (potatose dextrose agar) chứa chloramphenicol (100 µg/ml). Kháng sinh chloramphenicol có tác dụng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn. Đĩa được ủ ở 23oC trong tối 5 ngày. Hệ sợi nấm màu trắng xuất hiện từ các lát quả thể được thuần khiết bằng phương pháp tách bào tử đơn và cấy chuyển sang đĩa môi trường PDA mới. Chủng thuần khiết được nuôi cấy trực tiếp trên tiêu bản hiển vi vô trùng có chứa môi trường PDA để quan sát hình thái của hệ sợi nấm và cuống sinh bào tử dưới kính hiển vi quang học
(A) Quả thể nấm; (B, C) Chủng G12 trên môi trường PDA;
(D, E) Cấu trúc hệ sợi và bào tử; (F, G) Phân tích phát sinh chủng loại chủng G12 dựa trên trình tự ITS của rDNA.
Kết quả cho thấy, chủng C. militaris G12 chỉ bị ức chế bởi hygromycin ở nồng độ 200 μg/ml. Hiệu quả chuyển gen vào chủng C. militaris G12 nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens với marker chọn lọc là gen kháng hygromycin đạt trung bình 800 thể chuyển gen/106 bào tử. Việc chuyển thành công gen chỉ thị DsRed và GFP vào hệ gen của C. militaris G12 đã được xác nhận bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu.
ntqnhu
Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Số 05/2020